Биохимия азотфиксации

Азотфиксация – это уникальный процесс, характерный только для прокариотной клетки. Среди царства прокариот способны фиксировать молекулярный азот различные анаэробные и аэробные бактерии, сине-зеленые водоросли.

К азотфиксации способны бактерии родов Azotobacter и Clostridium (Cl. butyricum, Cl. acetobutylicum, Cl. felsineum).

Самым активным азотфиксатором является  Cl. pasteurianum, выделенный в чистую культуру С.Н. Виноградским в 1893 г. Cl. pasteurianum – типичный хемоорганотроф, который источником углерода использует  различные  органические соединения, источником азота – соли аммония, нитраты, а также органические азотсодержащие вещества. При дефиците азота в среде данный микроб переходит к фиксации молекулярного азота. Энергию для процессов жизнедеятельности  и  азотфиксации Cl. pasteurianum получает за счет маслянокислого брожения.

Средняя активность азотфиксации составляет 10-12 мг азота на 1 г сброженного сахара. Cl. pasteurianum выделяется из всех типов почв. Преобладает он на слабо аэрированных почвах, затопляемых водой.

Второй свободноживущий азотфиксирующий микроорганизм рода Azotobacter выделен М. Бейеринком в 1901 г. из садовой почвы.

Способность к азотфиксации проявляют и другие бактерии   семейства  Azotobacteraceae, относящиеся к родам Derxia, Аzоmопаs, Beijerinckia.

Большую роль в биологической азотфиксации играют сине-зеленые водоросли. К настоящему времени азотфиксирующая способность открыта более чем у 40 видов цианобактерий. Наибольшую активность к азотфиксации проявляют представители родов Amorphonostoc, Аnаbаеnа, Aulosira, Calothrix, Cy1indrospermum, Nostoc, To1ypothrix, Scytonema [1, с. 130-132].

Азот атмосферы могут фиксировать прокариотические микроорганизмы – диазотрофы. Большинство азотфиксаторов – гетеротрофные организмы, но имеются и фототрофы (цианобактерии). Азотфиксирующие микроорганизмы развиваются в широком диапазоне pH и rH₂ среды [2, с. 422].

Связывание азота – это ферментативный процесс его восстановления, осуществляемый поэтапно:

N≡N → NH=NH → NH₂–NH₂ → 2NH₃

Диимид     Гидразин  

Конечный продукт восстановления − аммиак, свидетельствует об окончании фиксации N₂ и включении его в биосинтетические процессы.

Восстановление азота происходит под воздействием нитрогеназной системы. При отсутствии молекулярного азота нитрогеназная система восстанавливает протоны до молекулярного водорода. Азотфиксирующие бактерии содержат также гидрогеназу, активирующую Н₂. Гидрогеназа активирует водород, образующийся при фиксации молекулярного азота, поскольку нитрогеназа высокочувствительна к образуемому при ее участии водороду.

Фиксация N₂ осуществляется в условиях низкого окислительно-восстановительного потенциала, при этом затрачивается несколько молекул АТФ на каждую молекулу образующегося NH₄⁺.

Синтез нитрогеназы прекращается в присутствии связанного азота. Под действием кислорода нитрогеназы необратимо инактивируются. Влияние О₂ на фиксацию N₂ живыми клетками носит сложный характер. С одной стороны, для аэробных микроорганизмов необходим О₂, чтобы поддерживать окислительное фосфорилирование для генерации АТФ, с другой, необходимы защитные системы, предохраняющие нитрогеназу от инактивации кислородом в клетках.

Во избежание повреждения нитрогеназы кислородом такие аэробы, как Azotobacter, используют дыхательную защиту, при которой избыток кислорода расходуется на холостое окисление органического субстрата, что обеспечивает интенсивный перенос электронов к нитрогеназному комплексу и удаление кислорода от места локализации нитрогеназы. Другой способ защиты нитрогеназы от повреждения при повышении концентрации O₂ – изменение ее конформационного состояния и снижение ее активности. При снижении концентрации O₂ нитрогеназная активность восстанавливается.

В клетках некоторых цианобактерий защита нитрогеназы обеспечивается разной локализацией систем фиксации N₂ и оксигенного фотосинтеза. Процесс фиксации N₂ локализован в гетероцисте – толстостенной дифференцированной вегетативной клетке с четко выраженными физиологическими и биохимическими особенностями. Ферменты, отвечающие за фиксацию молекулярного азота в гетероцистах, защищены толстой клеточной стенкой от атмосферного кислорода и кислорода, выделяемого в процессе оксигенного фотосинтеза [2, с. 424-425].

Азотфиксаторы представляют практический интерес, поскольку во многих случаях способны заменить неорганические источники азота, необходимые для полноценного развития биологических процессов, на более экологически совместимые. Особенно перспективны свободноживущие азотфиксаторы из семейства Azotobacteraceae, которые не только фиксируют азот, но и могут синтезировать и выделять в окружающую среду биологически активные вещества, благоприятно влияющие на развитие почвенных и водных биоценозов.

Представители семейства Azotobacteraceae – типичные обитатели почв, водных сред и поверхностей растений – ризосферы и филлосферы. Все виды р. Azotobacter аэробы. Энергию, необходимую для фиксации азота, они получают в процессе интенсивного дыхания. При низкой концентрации кислорода в среде они фиксируют молекулярный азот активнее, поскольку нитрогеназа чувствительна к высокой концентрации кислорода.

Бактерии р. Azotobacter способны использовать такие органические со-единения, как моно- и дисахариды, полисахариды (декстрин, крахмал), спирты, органические кислоты, в том числе ароматические, а также оксид углерода. Практическое значение имеет способность азотобактера расти на жирных кислотах (уксусной, масляной), что важно для восстановления плодородия почвы, поскольку жирные кислоты образуются при микробиологическом разложении клетчатки в почве.

Все виды р. Azotobacter утилизируют аммоний как единственный источник азота, большинство их видов способны использовать нитраты. Эти источники азота ассимилируются предпочтительнее молекулярного азота. Азотсодержащие соединения в небольших концентрациях не подавляют фиксацию азота этими микроорганизмами, а иногда даже стимулируют её. С увеличением содержания связанного азота в среде полностью подавляется усвоение молекулярного азота.

Азотобактер чувствителен к условиям внешней среды и развивается только в хорошо аэрируемых условиях при pH не ниже 6 (оптимум 7,2-8,2), однако некоторые штаммы могут расти и фиксировать азот при pH 5,1. Минимальная температура роста 9°С, оптимальная 28°С.

Азотобактер проявляет высокую потребность в органических веществах, поэтому в большом количестве встречается в хорошо удобренных почвах. Для роста он нуждается в минеральных элементах, особенно в фосфоре и кальции. Для активной азотфиксации микроорганизмам требуются микроэлементы, особенно молибден, который входит в состав нитрогеназы, катализирующей фиксацию азота.

В системах биологической очистки азотобактер может усваивать труд-ноокисляемые соединения и обогащать среду азотом и витаминами. Однако при использовании его для очистки сточных вод образующаяся мощная капсула вокруг его клетки затрудняет осаждение активного ила во вторич-ных отстойниках. Кроме того, из-за сравнительно низкой скорости роста он вытесняется из процесса другими организмами [2, с. 427-428].

Азотфиксация – сложный ферментативный процесс. Атомы молекулярного азота соединены тройной связью. Для их разрыва необходимо большое количество энергии. Энергия для разрыва приходит с ферментом в виде АТФ. Разрыв каждой связи идёт с затратами различного количества энергии, соответственно, 523 кДж/моль, 264 кДж/моль и 155 кДж/моль.

После разрыва связи фермент – нитрогеназа встраивает в молекулу азота водород.

Постадийное восстановление молекулярного азота сначала до диимина NH = NH, затем до гидразина NH₂  - NH₂  и в конечном счете до аммиака NН₃.

Подсчитано, что для восстановления одной молекулы азота до аммиака затрачивается не менее 12 молекул АТФ. Энергию, затрачиваемую на этот процесс, симбиотические азотфиксаторы получают в форме АТФ из митохондрий растительной клетки-хозяина, а свободноживущие азот-фиксирующие микроорганизмы добывают ее в реакциях катаболизма бактериальной клетки [1, с. 133].