ГЕНЕТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ПАЦИЕНТА С СИНДРОМОМ САНФИЛИППО

GENETIC CASE STUDY OF SANFILIPPO SYNDROME PATIENT

Alizada Sevda Aydin

Docent, PhD on Biology, Azerbaijan Medical University, Azerbaijan, Baku

Rasulov Elkhan Mammad Rasul

Professor, SciDr (Biology - Human genetics), Genom clinic laboratory, Azerbaijan, Baku

Аннотация. Впервые в Азербайджанской Республике проведено медико-генетическое обследование больных детей с целью диагностики синдрома Санфилиппо - лизосомной болезни накопления. Для всех четырех типов синдрома Санфилиппо активность ферментов определяли в крови методом масс-спектрометрии. ДНК, полученная из образца периферической крови пациента, была проанализирована методом NGS (секвенирование cледующего поколения). Выявлен полный дефицит только одного фермента – гепаран ацетил-КоА-глюкозаминид-N-ацетилтрансферазa. Это состояние характерно для типа С синдрома Санфилиппо. Результат генетического анализа показал нам дупликацию нуклеотидов G в положении 1345 экзона 13 в гомозиготном состоянии (c.1345dupG). Кроме того, показатели малой фракции гемоглобина (HbA₂, HbF) подтвердили, что больной является гетерозиготным носителем бета-талассемии. Учитывая репродуктивный возраст родителей, мы предложили им пренатальную диагностику плода при следующей беременности.

Abstract. For the first time in the Republic of Azerbaijan, a medical and genetic examination of sick children was conducted in order to diagnose the syndrome of Sanfilippo - lysosomal accumulation disease. For all four types of Sanfilippo syndrome, enzyme activity was determined in the blood by mass spectrometry. The DNA obtained from the patient's peripheral blood sample was analyzed by NGS (next generation sequencing). There was a complete deficiency of only one enzyme – heparan acetyl-CoA-glucosaminide-N-acetyltransferase. This condition is characteristic of type C of Sanfilippo syndrome. The result of the genetic analysis showed us the duplication of G nucleotides at position 1345 of exon 13 in the homozygous state (c.1345dupG). In addition, the indicators of a small fraction of hemoglobin (HbA2, HbF) confirmed that the patient is a heterozygous carrier of beta-thalassemia. Taking into account the reproductive age of the parents, we offered them prenatal diagnosis of the fetus during the next pregnancy.

Ключевые слова: синдром Санфилиппо; пренатальная диагностика; генетический анализ.

Keywords: Sanfilippo syndrome; prenatal diagnosis; genetic analysis.

Синдром Санфилиппо (мукополисахаридоз III типа), являющийся лизосомальной болезнью накопления, вызывает полиорганную недостаточность из-за накопления гепарансульфата (HS) в клетках и тканях. Ранние проявления можно рассматривать как когнитивные изменения, неврологические расстройства, задержку речи (потерю), регресс приобретенных навыков, гиперактивность, аутистический спектор, бессонницу, эпилепсию, агрессивность, трудности с передвижением, гепатомегалию [6]. Синдром Санфилиппо имеет генетические формы A, B, C и D с очень похожими клиническими проявлениями. Каждый ген формы локализуется в разных хромосомах. Ген Санфилиппо типа А расположен на длинном плече 17-й кромосомы (17q25) и обеспечивает синтез фермента N-сульфоглюкозаминсульфогидролазы (SGSH: 605270). Ген фермента N-альфа-ацетилглюкозаминидазы (NAGLU: 609701), ответственный за Санфилиппо типа В, расположен на длинном плече хромосомы 17 (17q21). Ген HGSNAT (610453) при синдроме Санфилиппо типа С локализуется на коротком плече хромосомы 8 и участвует в синтезе гепаранацетил-КоА-глюкозаминид-N-ацетилтрансферазы. Ген синдрома Санфилиппо типа D расположен на длинном плече хромосомы 12 (12q14) и обеспечивает синтез фермента N-ацетилглюкозамин-6-сульфатазы (607664). Тип наследования - аутосомно-рецессивный [4,7]. Следует отметить, что проблемы, связанные с болезнями накопления лизосом, не изучаются у детей-пациентов в Азербайджанской Республике. Данные о клинических проявлениях лизосомы полностью отсутствуют. Опубликованы наши справочные данные о генетических исследованиях случаев указанных мукополисахаридозов в Азербайджане. Данное исследование является продолжением этих исследований [1-3]. Следует также отметить, что в Азербайджане наблюдается высокая частота носительства бета-талассемии. Примерно через 10 лет планируется провести скрининг супружеских пар до вступления в брак, чтобы выявить пары с риском развития бета-талассемии. Этот скрининг предназначен для выявления таких пар для дальнейшей пренатальной диагностики плода во время беременности. Число гетерозигот по бета-талассемии в некоторых регионах республики достигает 10% и даже выше.

Целью  исследования является идентификация и генетическое изучение мукоплисахаридозов III типа (синдром Санфилиппо) с использованием современных методов биохимической и молекулярной диагностики. Принимая во внимание высокую распространенность бета-талассемии среди населения нашей Республики, мы поставили задачу выявить и изучить генетику гена бета-глобина (HBB). Пациент обнаружен во время медико-генетической консультации в одном из медицинских центров города Баку, Азербайджан. Медико-генетическая консультация проводилась в присутствии врача-педиатра и врача-генетика. Клинические проявления соответствовали мукополисахаридозу III типа (синдром Санфилиппо). Пациент страдает этим заболеванием с раннего детства в виде “специфических нарушений поведения”. Умственная отсталость, отсутствие контактов с обществом, агрессивность и нарушения речи, а также грубые черты лица. Для диагностики синдрома Санфилиппо мы использовали мочу и капиллярную кровь, абсорбированные и высушенные в карточках DBS (Dry Blood Spot), а также венозную кровь в объеме 2 мл. Диагностику бета-талассемии проводили с помощью электрофореза гемолизата, приготовленного из венозной крови, одновременно оценивая фетальный гемоглобин. Результаты электрофореза гемоглобина с последующей количественной оценкой фракции HbA2 показали ее увеличение до 4,3% при норме 3,5% от общего содержания гемоглобина. Также был повышен уровень фетального гемоглобина (HbF) - 4,3% (норма - 2,5%). Следовательно, показатели малой фракции гемоглобина (HbA2, HbF) свидетельствуют о том, что пациент является гетерозиготным носителем бета-талассемии. Учитывая, что в основе всех мукополисахаридозов лежит нарушение активности ферментов, мы начали с определения уровней ферментов, специфичных для каждого из четырех типов синдрома Санфилиппо (A, B, C и D). Были использованы следующие ферменты: Гепаран-N-сульфатаза (Санфилиппо А), альфа-N-ацетил-D-глюкоаминидаза (Санфилиппо В), гепаранацетил-КоА-глюкозаминид-N-ацетилтрансфераза (Санфилиппо С) и фермент N-ацетилглюкозамин-6-сульфатаза (Санфилиппо D). У пациента был выявлен общий дефицит активности фермента гепаранацетил-КоА-глюкозаминид-N-ацетилтрансферазы, характерный для Санфилиппо типа С. Здесь мы наблюдали полный дефицит фермента с нулевой активностью (0,0 (LOD)мкмоль/л/ч), что характерно для гомозиготного или двойного гетерозиготного (сложного) состояния, когда норма должна составлять ≥2,0 мкмоль/л/ч. Генеалогический анализ позволил нам установить, что родители пациента были родственниками - двоюродный брат по брачному типу. Ферментативный анализ родителей индексного пациента показал следующий случай: у родителей выявлен дефицит фермента, соответствующий гетерозиготным носителям. ДНК, полученная из образца периферической крови пациента, была исследована с помощью метода NGS (секвенирования нового поколения). Средняя глубина считывания состоит из 1559 показаний.

Centogene ® установила строгие критерии качества и процессы валидации для вариантов, обнаруженных NGS. Классификация патогенности полученных результатов была рассмотрена в соответствии с «Руководящими принципами ACMG*». Одновременно было проведено секвенирование гена SGSH [5]. Для постановки первичного диагноза мы провели количественный и качественный анализ на содержание гликозамингликанов (GAG) в моче методом тонкослойной хроматографии. В качестве точного метода диагностики мы проанализировали сыворотку крови, лейкоциты, фибробласты, чтобы оценить активность соответствующих ферментов. Генетический анализ на уровне ДНК делает диагностику более точной.

Метод масс-спектрометрии был использован для оценки активности ферментов при всех четырех типах синдрома Санфилиппо. Мы получили полный дефицит только одного фермента: гепаранацетил-КоА-глюкозаминид-N-ацетилтрансферазы. Это состояние характерно для синдрома Санфилиппо типа С. Молекулярный анализ гена HGSNAT (NM_152419) был проведен с использованием метода NGS (секвенирование следующего поколения). Результат генетического анализа показал нам удвоение G-нуклеотида в позиции 1345 экзона 13 в гомозиготном состоянии (c.1345dupG). В результате мутации происходит сдвиг рамки считывания, и нормальный кодон 21 заменяется стоп-кодоном. Следовательно, происходит замена аспарагина в нормальном белке глицином в положении 449, вызванная указанной выше мутацией (Asp449Glyfs*21).

Таким образом, впервые в Азербайджанской Республике было проведено медико-генетическое исследование пострадавших детей с целью диагностики синдрома Санфилиппо - лизосомальной болезни накопления. Нам удалось выявить дополнительную мутацию гена HBB в гетерозиготном состоянии. Замена цитозинового нуклеотида на гуаниновый нуклеотид произошла в позиции 745 интрона 2 в гене HBB (IVS II-745 C>G).

Таким образом, мы обнаружили полный дефицит гепаранацетил-КоА-глюкозаминид-N-ацетилтрансферазы и идентифицировали мутацию гена HGSNAT c.1345dupG: Asp449Glyfs*21. Учитывая репродуктивный возраст родителей, мы предложили им пренатальную диагностику плода при следующей беременности.