ПОЛИПЛЕКСЫ ПРОИЗВОДНЫХ ХИТОЗАНА, КАК НЕВИРУСНЫЕ ВЕКТОРЫ ДОСТАВКИ КОРОТКИХ ИНТЕРФЕРИРУЮЩИХ РНК, НАПРАВЛЕННЫХ НА ПОДАВЛЕНИЕ РЕПЛИКАЦИИ ВИРУСА ГРИППА A

Известно, что короткие интерферирующие РНК (киРНК) могут служить мощными ингибиторами репликации вирусов. Они превосходят традиционные низкомолекулярные противовирусные препараты в легкости дизайна, низкой стоимости изготовления и возможности быстрой модификации препарата [1].

Тем не менее, широкое применение специфических киРНК в качестве терапевтических агентов ограничено рядом трудностей, связанных с доставкой коротких двухцепочечных молекул РНК внутрь клетки и сохранением их функциональной стабильности. Во-первых, киРНК обладают отрицательным электростатическим зарядом, что затрудняет пассивное проникновение в клетку через плазматическую мембрану [4]. Во-вторых, немодифицированные киРНК очень нестабильные молекулы, период их полужизни составляет всего лишь несколько минут после внутривенного введения [3], что принято связывать с действием нуклеаз, содержащихся в сыворотке крови.

На данный момент существует два типа систем доставки киРНК в клетки. Первый тип – вирусные векторы, основными преимуществами которых являются высокая трансфекционная эффективность и органоспецифическая избирательность доставки генетического материала [2]. Однако, такие системы индуцируют иммунный ответ, что является существенным недостатком и делает их непригодными для широкого применения в клинической практике терапии вирусных инфекций. Второй тип – невирусные системы доставки, к которым относят полиплексы, катионные пептиды, липосомы, квантовые точки и др. К одним из наиболее перспективных носителей относят полиплексы – полимерные катионные молекулы, производные хитозана, проявляющие низкую токсичность, биосовместимость, биодеградируемость и слабую иммуногенность [6].

Целью настоящей работы являлось сравнение биологических свойств поликатионных носителей – производных хитозана, для доставки киРНК, направленных на подавление репликации вируса гриппа A человека in vitro.

Для достижения этой цели решались следующие задачи:

1.  Создать стабильные дуплексы киРНК из одноцепочечных РНК-олигонуклеотидов, направленных на консервативные области гена PA вируса гриппа A в качестве мишени.

2.  Определить РНК-связывающие активности и токсичность поликатионных носителей.

3.  Провести анализ трансфекционной активности поликатионных носителей при помощи флуоресцентной микроскопии.

Материалы и методы исследования.

Химические вещества.

Поликатионы.

Для дальнейшего анализа были выбраны следующие поликатионы-носители: хитозан метилгликоль chMGly (Sigma), хитозан гидрохлорид chHCl (Sigma), хитозан олиголактат chOL (Sigma), а также полиэтиленимин (ПЭИ) (25кДа) и Lipofectamine2000 (Invitrogen) в качестве препаратов сравнения образования комплексов с РНК и положительного контроля доставки генетического материала в клетку.

Короткие интерферирующие РНК.

Согласно задаче исследования, необходимо было найти киРНК против вируса гриппа A, направленные на ген PA в качестве мишени. Были подобраны и синтезированы («ДНК-Синтез») РНК-олигонуклеотиды комплементарные различным консервативным областям гена РА, как кодирующей его части, так и 3’UTR области (рис. 1.). В целях повышения стабильности РНК олигонуклеотидов некоторые из них были модифицированы на концах dTdT.

Методы.

Создание стабильных двунитевых киРНК.

Для получения двухцепочечных дуплексов растворы одноцепочечных РНК-олигонуклеотидов с конечной концентрацией 10 pmol/µl сливали эквимолярно. Затем помещали в термоциклер CFX96 (BioRad, США) для дальнейшей термической обработки со следующими параметрами: быстрый нагрев до 95˚С; плавное понижение температуры до 35˚С с понижением на 1˚С в течение 30 секунд; охлаждение с 35˚С до 5˚С с понижением на 1˚С за минуту. Результаты образования двуцепочечных дуплексов проверяли методом электрофоретического разделения в 15 % полиакриламидном геле (U=220 В, J=45мА). В качестве положительного контроля использовали коммерческую киРНК AllStarsNegativeControlsiRNA AF 546 (Invitrogen, США). В качестве отрицательного контроля использовали эквимолярно слитые растворы одноцепочечных олигонуклеотидов РНК без температурной обработки. Также методом электрофоретического разделения проверялась стабильность двунитевых киРНК после инкубации в течении недели при 35˚С в воде и клеточной среде αMem.

Рисунок 1. Консервативные области гена PAвирусов гриппа А и кодируемых им мРНК и последовательность противовирусной киРНК, направленной на выключение экспрессии гена PA вирусов гриппа А

Комплексообразование поликатионов с киРНК.

Для создания комплексов киРНК с поликатионами смешивались равные объемы водных растворов киРНК и растворов поликатионов с различной концентрацией, чтобы получить разные соотношения поликатион-РНК. Соотношение рассчитывалось либо по массе поликатиона на 1 нг киРНК, либо по мольному соотношению N/P-азотных групп поликатиона к фосфатным группам РНК (в расчёте на один нуклеотид и одно мономерное звено) по следующей формуле:

Комплексы эффективно перемешивались встряхиванием, осаждались на вортексе и инкубировались при комнатной температуре в течение 1 часа. Проверка связывания киРНК с поликатионом осуществлялась методом электрофоретического разделения в 15 % полиакриламидном геле по гашению флуоресценции бромистого этидия для дцРНК, связанной в комплекс с поликатионом.

Определение токсичности поликатонов.

Микротетразолиевый тест (МТТ) использовался для определения цитотоксичности растворов поликатионов [4]. Для этого к клеткам MDCK, посеянным в 96-луночные планшеты, добавляли растворы поликатионов и инкубировали одни сутки при 37°C. По истечении данного срока клетки промывали фосфатным солевым буфером (ФСБ) и добавляли в каждую ячейку по 100 мкл раствора (с концентрацией 5 мг/мл) 3-(4,5-диметилтиазолил-2) 2,5-дифенилтетразолия бромида на ФСБ, после чего клетки оставляли на инкубацию в течение 2 часов при 37°C до образования фиолетового осадка, который образуется в митохондриях в ходе клеточного дыхания. Затем жидкость из ячеек удаляли, в каждую лунку к осадку добавляли по 100 мкл ДМСО, после чего измеряли оптическую плотность в лунках планшетов на планшетном ридере Victor 1420 (Perkin Elmer, Finland) при длине волны 535 нм.

Определение трансфекционной активности поликатионов.

Для оценки эффективности доставки киРНК в клетки MDCK использовалась коммерческая siRNA-AF546, меченная флуоресцентным красителем AlexaFlour 546. Эффективность такой трансфекции с использованием chMGly, ПЭИ и Lipofectamine2000 оценивали визуально в процессе наблюдения в флуоресцентном микроскопе в реальном времени.

РЕЗУЛЬТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

В предварительном эксперименте было показано, что chMGly за 1 час инкубации при комнатной температуре образует комплекс с киРНК в массовых соотношениях 10000:1, 1000:1 и 100:1 (рис. 3). При этом chOL и chHCl в тех же соотношениях не образуют комплексов с киРНК. Далее таким же образом было определено пороговое соотношение N/P для chMGly и ПЭИ, при соблюдении которых образовывается стабильный комплекс киРНК-поликатион, подходящий для доставки киРНК в клетки (рис. 4).

1,8,12 – контроль - siRNAAF546, 2,3,4 – комплексы MGlyCh с siRNAAF546 с массовыми соотношениями в нг. 100:1, 1000:1, 10000:1 соответственно; 5, 6, 7 – комплексы OLCh с siRNAAF546 с массовыми соотношениями в нг. 10000:1, 1000:1, 100:1соответственно; 9,10,11 - комплексы HClCh с siRNAAF546 с массовыми соотношениями в нг. 10000:1, 1000:1, 100:1 соответственно

Рисунок 3. Электрофоретическое разделение комплексов поликатион-РНК

Рисунок 4. Электрофоретическое разделение комплексов chMGly–киРНК, ПЭИ-ки РНК

Из данных анализа токсичности поликатионов были выбраны предельно допустимые концентрации поликатионов для трансфекции клеток комплексами chMGly–киРНК, ПЭИ-ки РНК. В соответствие с пороговыми значениями N/P были получены комплексы chMGly–киРНК, содержащие 20 пМ РНК и 100 нг хитозана (N/P=1/4), и комплексы ПЭИ-киРНК, также содержащие 20 пМ РНК и 330 нг хитозана (N/P=5/1). Комплексы были добавлены в 50 мкл безсывороточной среды αМем к клеткам MDCK в лунки 96 луночного планшета (10⁴ клеток на лунку). После 15 часов инкубации среду сливали, и клетки отмывали стерильным раствором ФСБ несколько раз, чтобы исключить налипание комплексов на клеточные мембраны, и далее оценивали количество клеток, содержащих флуоресцентную метку визуально (рис. 5).

Рисунок 5. Флуоресцентно меченая siRNA AF546 в клетках MDCK после трансфекции комплексами Lipofectamine2000-киРНК (1), ПЭИ-ки РНК (2), chMGl –киРНК (3) и киРНК без носителя (4). Увеличение – 20х

ВЫВОДЫ.

По совокупности данных проведенных исследований было определено, что наибольшей связывающей способностью и наименьшей токсичностью в концентрации, соответствующей оптимальному соотношению N/P для комплексообразования, из всех исследованных производных хитозана обладает метилгликоль хитозан (chMGly). Для него была показана максимальная трансфекционная активность (>50 % от общего числа клеток) для доставки киРНК, содержащей флуоресцентную метку. Полученные данные позволяют использовать данный поликатион для дальнейших in vitro исследований противовирусной (в отношении вирусов гриппа А) активности препаратов киРНК.

Список литературы:

1. Barik S. SiRNA for influenza therapy // Viruses. 2010. № 7 (2). C. 1448–1457.
2. Hedley S. [и др.]. An adenovirus vector with a chimeric fiber incorporating stabilized single chain antibody achieves targeted gene delivery // Gene therapy. 2006.
3. Kumari A., Kumar V., Yadav S.K. Nanocarriers: a tool to overcome biological barriers in siRNA delivery. // Expert opinion on biological therapy. 2011. № 10 (11). C. 1327–1339.
4. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays // Journal of immunological methods. – 1983. – Т. 65. – № 1. – С. 55–63.
5. Zhou H. [и др.]. Effective small interfering RNAs targeting matrix and nucleocapsid protein gene inhibit influenza A virus replication in cells and mice // Antiviral Research. 2007. № 2 (76). C. 186–193.
6. Занг К. [и др.]. Низкомолекулярные алкилированные хитозаны как невирусные векторы трансфекции для генной терапии 2007. C. 81–88.