АНАЛИЗ РОСТОВЫХ ХАРАКТЕРИСТИК СУСПЕНЗИОННЫХ КУЛЬТУР АЛТЕЯ ЛЕКАРСТВЕННОГО И ШАЛФЕЯ ЛЕКАРСТВЕННОГО

Суспензионные культуры растительных клеток являются удобной моделью для проведения молекулярно-биологических и физиолого-биохимических исследований, а также находят широкое применение в биотехнологии растений. Возобновляемым источником ценных фармакологически активных соединений могут служить культуры клеток лекарственных растений. К основным их преимуществам относится гарантированное получение экологически чистых продуктов независимо от сезона, климатических и погодных условий, создание клеточных линий-сверхпродуцентов, возможность автоматизации процесса культивирования, в т. ч. с использованием стандартного оборудования микробиологических производств (биореакторов, постферментационных систем и др.) и др. [2, с. 44].

В зависимости от источника получения и условий культивирования суспензионные культуры могут достаточно сильно различаться. Основными их характеристиками являются скорость роста, плотность, степень агрегированности, жизнеспособность клеток [6, c. 205]. Скорость роста чаще всего оценивают на основе анализа сырого либо сухого веса клеток. По плотности суспензии можно не только охарактеризовать состояние клеточной популяции, но и определить время субкультивирования (отбора инокулюма и пересадки на свежую питательную среду).

Алтей лекарственный (Althaea officinalis L.) относится к слизеполифенолсодержащему лекарственному сырью [1, с. 25]. В фитохимическом аспекте наиболее хорошо изучены полисахариды корней алтея. Листья и соцветия содержат хлорогеновые кислоты, биофлавоноиды и дубильные вещества, поэтому перспективны в качестве источника для получения лекарственных препаратов Р-витаминного действия [5, с. 10]. Следует отметить, что запасы сырья алтея лекарственного в естественных условиях ограничены и недостаточны для широкой промышленной заготовки. Учитывая этот факт, алтей лекарственный достаточно давно введен в культуру. В культуре алтей размножается исключительно семенами, однако при хранении, после первого года вегетации семена имеют слабую энергию прорастания и относительно низкий процент всхожести. В связи с этим значительный практический интерес представляет использование культуры клеток алтея лекарственного в качестве источника биологически активных веществ, обладающих противовоспалительным, Р-витаминным и др. действием.

Шалфей лекарственный (Salvia officinalis L.) официальной фармацией и медициной признан как многосторонне действующее лекарственное растительное сырье. Противовоспалительные и антимикробные свойства шалфея связаны с содержанием в листьях дубильных и флавоноидных соединений, а также с присутствием в надземной части растения антибиотика сальвина, эфирного масла, витаминов P и PP [4, с. 333].

Целью работы было получение суспензионных культур Althаea officinalis L. и Salvia officinalis L. и установление закономерностей прироста их биомассы в течение ростового цикла.

Для инициации первичных клеточных суспензий алтея лекарственного и шалфея лекарственного использовали длительно пассируемые каллусные культуры рыхлого типа, которые легко фрагментировались на отдельные клетки и небольшие агрегаты при помещении в перемешиваемую жидкую среду. Выращивание суспензионных культур осуществлялось на питательной среде по прописи Мурасиге и Скуга, содержащей 3 % сахарозы и фитогормоны. В качестве ауксинов среды включали 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту в концентрации 0,2 мг/л и индолил-3-уксусную кислоту в концентрации 1,0 мг/л, в качестве цитокинина — 0,5 мг/л кинетина. Постоянное перемешивание питательной среды со скоростью 120 об/мин обеспечивали с помощью орбитального шейкера-инкубатора MaxQ 6000 Thermo Scientific. Культивирование осуществлялось при температуре 25°С в темноте. Сухой вес клеток суспензионных культур определяли после отделения сырой биомассы от питательной среды и ее высушивания при температуре 60°С до постоянного веса. Индекс роста культуры рассчитывали, как разницу между конечной и начальной сухой массой, отнесенной к начальной массе. Все эксперименты выполнены в 3-х кратной повторности.

Скорость прироста биомассы является важнейшей характеристикой любой культуры растительных клеток и тканей in vitro. В нашей работе ростовую активность суспензионных культур Althаea officinalis L. и Salvia officinalis L. определяли, анализируя динамику накопления массы сухого вещества в цикле выращивания. Для этого каждые 2—3 сут. после переноса инокулюма на свежую питательную среду производили определение сухого веса клеток, что позволило получить кривые роста суспензионных культур. В случае суспензионной культуры Althаea officinalis L. кривая роста имела лаг-период длительностью 2 сут., экспоненциальную фазу с 3 по 8 сут., затем наступала фаза замедления роста (9—10 сут.) и стационарная фаза (11—14 сут.), после чего отмечалась фаза деградации. Для суспензионной культуры Salvia officinalis L. продолжительность лаг-фазы составила 5 сут., фаза экспоненциального роста охватывала интервал с 6 по 12 сут., замедление роста отмечалось на 13—14 сут., а стационарная фаза была достаточно короткой (15—16 сут.), после чего культура в большинстве случаев приобретала темную окраску, свидетельствующую о запуске процессов старения.

В целом следует отметить, что кривые роста обеих культур имели характерный S-образный вид, однако динамика прироста их биомассы отличалась. Расчет индекса роста показал, что суспензионная культура Althаea officinalis L. обладает, как минимум, вдвое более высокой ростовой активностью по сравнению с суспензионной культурой Salvia officinalis L.

С целью получения суспензионных культур с высокой пролиферативной активностью и оптимизации условий их культивирования in vitro очень важно учитывать плотность суспензии. Этот показатель зависит не только от состава питательной среды и физических условий культивирования, но и соотношения между объемом среды и клеточной биомассы. Если начальная клеточная плотность снижается ниже критической эффективной плотности (критическое минимальное количество клеток на единицу объема), суспензионная культура не будет расти, а при плотности клеток, превышающей критический уровень, удлиняется лаг-фаза и фаза экспоненциального роста [3, c. 161]. В связи с этим представляло интерес исследование влияния начальной массы инокулюма на прирост биомассы суспензионных культур Althаea officinalis L. и Salvia officinalis L. Полученные данные приведены в таблице 1.

Таблица 1.

Величины индекса роста суспензионных культур в зависимости от начального размера инокулюма

Наиболее высокие значения индекса роста исследуемых культур достигались при начальной массе инокулюма равной 1,8—1,9 г/л. Ее увеличение приводило к заметному снижению индекса роста обеих суспензионных культур. Если в случае клеточной суспензии Salvia officinalis L. возрастание начальной массы инокулюма в 2,5 раза сопровождалось снижением индекса роста в среднем в 2 раза, то для суспензионной культуры Althаea officinalis L. — практически в 4 раза. Следовательно, изначально высокая плотность суспензионной культуры приводит к дальнейшему торможению прироста биомассы, что, вероятно, связано с более быстрым истощением питательной среды, а также накоплением нежелательных продуктов жизнедеятельности.

Установленные закономерности прироста биомассы суспензионных культур Althаea officinalis L. и Salvia officinalis L. в дальнейшем могут найти применение при разработке эффективных режимов их биотехнологического использования в качестве источников фармакологически активных соединений, альтернативных традиционно используемому природному лекарственному сырью.

Список литературы:

1. Алтей лекарственный Althaea officinalis L. (Аналитический обзор) / Б.М. Зузук [и др.] // Провизор. — 2005. — С. 25—31.
2. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе / Р.Г. Бутенко. — М.: «ФБК-ПРЕСС», 1999. — 160 с.
3. Калинин Ф.Л. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений. / Ф.Л. Калинин, В.В. Сарнацкая, В.Е. Полищук. — Киев: «Наук. Думка», 1980. — 480 с.
4. Куркин В.А. Фармакогнозия: Учебник для фармацевтических вузов и факультетов / В.А. Куркин. — Самара: «СамГМУ», 2004. — 1239 с.
5. Особенности сезонного накопления фенольных соединений в растениях алтея лекарственного (Althaea officinalis L.) при интродукции в Беларуси / Ж.А. Рупасова [и др.] // Весцi Нацыянальнай Акадэмii навук Беларусi. — 1999. № 3. — С. 10—14.
6. Современные проблемы и методы биотехнологии — [Электронный ресурс] — / Н.А. Войнов [и др.]: под науч. ред. Т.Г. Волковой. — Красноярск: «ИПК СФУ», 2009. — 418 с. — Режим доступа. — URL: http://files.lib.sfu-kras.ru/ebibl/umkd/1323/u_manual.pdf (Дата обращения 07.09.2015).