Влияние модифицированных водорастворимых фуллеренов на подвижность мужских половых клеток

The Influence of modified water-soluble fullerenes on the mobility male sperm cells

Svetlana Rudneva

PhD, senior researcher of the laboratory genetics of reproduction disorders of Research Centre for Medical Genetics

Svetlana Ermolaeva

Researcher of the laboratory genetics of reproduction disorders of Research Centre for Medical Genetics

Ol'ga Kraevaya

Junior researcher at the laboratory of functional materials for electronics and medicine at the Institute for Problems of chemical Physics of RAS

Svetlana Kostyuk

Doctor of biological sciences, chief of the laboratory of molecular biology of Research Centre for Medical Genetics

Pavel Umryukhin

Professor of the normal physiology department of Sechenov Uunversity, senior researcher of P.K. Anokhin institute of normal physiology

Vasilina Sergeeva

Researcher of the laboratory оf molecular biology of Research Centre for Medical Genetics

Pavel Troshin

PhD, chief of the laboratory of functional materials for electronics and medicine at the Institute for Problems of chemical Physics of RAS

Vyacheslav Chernykh

Chief of the laboratory genetics of reproduction disorders of Research Centre for Medical Genetics, doctor of medical sciences

Аннотация. Было изучено влияние модифицированных водо­растворимых фуллеренов С₈₅N₁₀H₆₀Cl₆, C₆₀P₅O₁₅H₆K₅, C₁₀₅O₁₀K₅ClH₄₀ (в концентрациях 1 мг/мл, 0.1 мг/мл и 0.01 мг/мл,1 мкг/мл и 0.1 мкг/мл) на подвижность сперматозоидов и изменение мембранного потенциала их митохондрий. Инкубация сперматозоидов с фуллеренами C₆₀P₅O₁₅H₆K₅, C₁₀₅O₁₀K₅ClH₄₀ сопровождается повышением их подвижности. Установлено, что чем ниже была концентрация указанных соединений, тем ярче проявлялся эффект увеличения подвижности сперматозоидов. При инкубации сперматозоидов с модифицированным фуллереном C₁₀₅O₁₀K₅ClH₄₀ отмечалось увеличение средней интенсивности внутри­клеточной флуоресценции маркера I _{MitoTracker Red} более чем в 2 раза при концентрации 0.01мг/мл и на 46% при концентрации 0.1мг/мл. Так как инкубация сперматозоидов с фуллеренами C₆₀P₅O₁₅H₆K₅, C₁₀₅O₁₀K₅ClH₄₀ в концентрации ниже 1 мг/мл в течение недели сопровождается сущест­венным повышением их подвижности, это указывают на отсутствие цитотоксичности этих соединений и на возможность их использования в качестве стимуляторов активности митохондрий сперматозоидов. Установлено, что модифицированный водорастворимый фуллерен С₈₅N₁₀H₆₀C_l6 является крайне токсичным для сперматозоидов.

Abstract. The influence of modified water-soluble fullerenes С₈₅N₁₀H₆₀Cl₆, C₆₀P₅O₁₅H₆K₅, C₁₀₅O₁₀K₅ClH₄₀ (in concentrations of 1 mg/ml, 0.1 mg/ml and 0.01 mg/ml, 1 µg/ml and 0.1 µg/ml) on sperm motility, as well as on the changes in the membrane potential of sperm cell’s mitochondria during their incubation with these compounds was studied. It was shown that the incubation of sperm cells with fullerenes C₆₀P₅O₁₅H₆K₅, C₁₀₅O₁₀K₅ClH₄₀ is accompanied by an increase in their mobility. The lower was the concentration of these compounds, the more was the increase of sperm cells motility. It could indicate a lack of cytotoxicity of these compounds as well as the possibility of their use as stimulants of the mitochondria activity of the sperm cells. It was also found that fullerene С₈₅N₁₀H₆₀C_l6 is extremely toxic to sperm cells.

Ключевые слова: фуллерены; сперматозоиды; митохондрии; подвижность.

Keywords: fullerenes; male sperm cells; mitochondria; mobility.

Расширенный реферат. The development of nanotechnology leads to the emergence of new forms of substances. Currently, fullerenes occupy a special place in the nanoindustry. Many experts consider them as a very promising material for medicine and biotechnology. The search for new biologically active compounds with antioxidant and radioprotective properties has led to the discovery of water-soluble fullerenes. The biological properties of this category of fullerenes and their functional derivatives are studied and already used to create new drugs and biomaterials.

The influence of modified water-soluble fullerenes С₈₅N₁₀H₆₀Cl₆, C₆₀P₅O₁₅H₆K₅, C₁₀₅O₁₀K₅ClH₄₀ (in concentrations of 1 mg/ml, 0.1 mg/ml and 0.01 mg/ml, 1 µg/ml and 0.1 µg/ml) on sperm motility, as well as on the changes in the membrane potential of sperm cell’s mitochondria during their incubation with these compounds was studied.

It was shown that the incubation of sperm cells with modified water-soluble fullerenes C₆₀P₅O₁₅H₆K₅, C₁₀₅O₁₀K₅ClH₄₀ in these concentrations is accompanied by an increase in their mobility. It was also found that the lower is the concentration of these compounds, the more is the increase of sperm cells motility.

It was shown that during the incubation of sperm cells with the modified fullerene C₁₀₅O₁₀K₅ClH₄₀ there was an increase in the average intensity of intracellular fluorescence of I _{MitoTracker Red} more than 2 times (by 120%) at a concentration of 0.01 mg/ml and by 46% at a concentration of 0.1 mg/ml. It was shown that the lower was the concentration of C₁₀₅O₁₀K₅ClH₄₀ during sperm cells incubation the more was the effect of transmembrane mitochondria potential (ΔΨm) increase. Similar results were found after one hour of incubation the mobile fraction of sperm cells with a modified fullerene C₆₀P₅O₁₅H₆K₅. However, the increase in the average intensity of intracellular fluorescence of the I_{MitoTrackerRed} marker was not so pronounced, although it also depended on the concentration of fullerene.

Since the incubation of sperm cells with modified water-soluble fullerenes C₆₀P₅O₁₅H₆K₅, C₁₀₅O₁₀K₅ClH₄₀ at a concentration below 1mg/ml for one week is accompanied by a significant increase of their mobility, it could indicate a lack of cytotoxicity of these compounds at that concentration as well as the possibility of their use as stimulant of the mitochondria activity of the sperm cells.

In the study it was found that modified water-soluble fullerene С₈₅N₁₀H₆₀C_l6 is extremely toxic to sperm cells. It was shown that the higher is the concentration of modified fullerene during incubation, the stronger is its toxic effect. The reduction of the sperm cells mitochondria transmembrane potential (ΔΨm) during the incubation with С₈₅N₁₀H₆₀C_l6 is consistent with the previously obtained data about the changes in sperm cells motility. Thus, the incubation of male sperm cells with this compound at a concentration of 1µg/ml and above leads to total immobilization and loss of viability.

Введение. Развитие нанотехнологий приводит к появлению новых форм веществ. В настоящее время фуллерены занимают особое место в наноиндустрии. Многие специалисты рассматривают их как весьма перспективный материал для использования в медицине и биотех­нологии. Широко известна противовирусная активность производных фуллеренов [1-4]. В работе [1] авторами показано, что производные фуллеренов способны размещаться внутри гидрофобной полости ВИЧ-протеазы, затрудняя доступ субстратов к каталитическому сайту фермента. Р.А. Котельниковой и соавторами в работе [5] показана способность аминокислотных производных фуллеренов ингибировать герпес-вирусную инфекцию. Кроме того, группой ученых были разра­ботаны производные фуллеренов, способные доставлять генетический материал при лечении генетических заболеваний [6]. Связываясь с плазмидой, они переносили ее в клетки с эффективностью, сопоставимой с коммерческими реагентами.

Молекула фуллерена представляет собой замкнутый симмет­ричный углеродный каркас с формой, близкой к сферической. Начиная с 1985 года, после открытия фуллеренов, было синтезировано значи­тельное число их модифицированных производных. Поиск среди них новых биологически-активных соединений с антиоксидантными, радио­протекторными свойствами привел к появлению водорастворимых форм фуллеренов. В настоящее время биологические свойства данной категории фуллеренов и их функциональных производных всесторонне изучаются и используются с целью создания на их основе новых лекарственных средств и биоматериалов [7, 8]. В связи с вышеизло­женным, мы считаем актуальным исследование влияния различных модификаций фуллеренов С₈₅N₁₀H₆₀Cl₆, C₆₀P₅O₁₅H₆K₅, C₁₀₅O₁₀K₅ClH₄₀ (рис. 1) на подвижность сперматозоидов. В наши задачи также входило исследование изменений мембранного потенциала митохондрий сперматозоидов в процессе их инкубации с данными соединениями.

Рисунок 1. Химические формулы используемых модификаций фуллеренов

Материалы и методы. Оценку параметров эякулята осуществляли по стандартам ВОЗ-2010 [9]. Сперматозоиды с поврежденной мембраной выявляли с использованием 1% водного раствора эозина. Модификации фуллеренов разводили до конечной концентрации в эякуляте – 1 мг; 0.1 мг; 0.01 мг/мл; 1 мкг/мл и 0.1 мкг/мл. Инкубацию проводили при температуре 20ºС.

Влияние модифицированных фуллеренов на состояние митохонд­рий cперматозоидов исследовали по изменению трансмембранного потенциала митохондрий (ΔΨm), используя потенциал-чувствительный маркер МитоТрекер Красный (MitoTracker Red, Molecular Probes, США) путем определения средней интенсивности флуоресценции на проточном цитофлуориметре. Исследуемые образцы, согласно методике изготови­теля, инкубировали в стандартных условиях (+37°С) в течение 0.5 часа с MitoTracker Red в конечной концентрации 0.5 мМ, затем образцы дважды отмывали фосфатно-солевым буфером (ФСБ), далее суспензию центрифугировали 10 минут при 500g, осадок ресуспендировали в ФСБ и анализировали на проточном цитофлуориметре «Partec».

Последующая обработка полученных результатов производилась с использованием программного обеспечения MS Excel. Полученные результаты исследований обработаны с учетом стандартных методик вариационной статистики. Данные представлены в виде М±m, различия между показателями считали достоверными при значении р<0.05.

Результаты и обсуждение. Влияние модифицированных фул­леренов С₈₅N₁₀H₆₀Cl₆, C₆₀P₅O₁₅H₆K₅, C₁₀₅O₁₀K₅ClH₄₀ на подвижность сперматозоидов.

Было изучено влияние модифицированных водорастворимых фуллеренов (в концентрациях 1 мг/мл, 0.1 мг/мл и 0.01 мг/мл) на подвижность сперматозоидов. Препараты подбирались с близкими значениями подвижности, чтобы уменьшить разброс показаний и инкубировались в течение 3 часов при температуре 20°. Показано, что в данных условиях (при различных концентрациях исследуемых веществ и времени инкубации с ними) соединения C₁₀₅O₁₀K₅ClH_40, C₆₀P₅O₁₅H₆K₅ способствовали увеличению подвижности сперматозоидов по сравнению с контролем. Максимальное увеличение наблюдалось при концентрациях C₁₀₅O₁₀K₅ClH₄₀ – 0.1 мг/мл и времени инкубации 3 часа – на 71%. Существенное увеличение подвижности спермато­зоидов – на 60% по сравнению с контролем было отмечено также при концентрации C₆₀P₅O₁₅H₆K₅ -0.1 мг/мл и времени инкубации 3 часа. Инкубация с модифицированным фуллереном С₈₅N₁₀H₆₀Cl₆, напротив, способствовала полному обездвиживанию сперматозоидов при кон­центрациях 1 мг/мл и 0.1 мг/мл (табл.1). При этом важно подчеркнуть, что падение подвижности сперматозоидов практически до нуля происходило уже в течение первого часа инкубации с исследуемым соединением, и к 3 часам приводило к полному обездвиживанию сперматозоидов.

Таблица 1.

Подвижность сперматозоидов при инкубации с модифицированным фуллереном С₈₅N₁₀H₆₀Cl₆ в разных концентрациях

В дальнейшем, были проведены более детальные эксперименты, в которых концентрации исследуемых соединений были уменьшены, а время инкубации сперматозоидов с ними увеличено. Для этого предва­рительно была выделена подвижная фракция сперматозоидов согласно протоколу фирмы изготовителя (ПанЭко, Среда ЭКО 1 "Спермопреп"). Препараты также подбирались с близкими значениями подвижности, чтобы уменьшить разброс показаний.

Было показано, что при инкубации подвижной фракции спер­матозоидов с исследуемым веществом C₁₀₅O₁₀K₅ClH₄₀ в концентрации 0.1 мкг/мл наблюдалось наибольшее увеличение подвижности сперма­тозоидов по сравнению с контролем в течение всех трех дней (табл. 2). Увеличение подвижности сперматозоидов по сравнению с контролем наблюдалось при всех временных интервалах от 3 ч до 3 суток на 43 % - 60% соответственно (табл. 2). Однако, при концентрации C₁₀₅O₁₀K₅ClH₄₀ 0.01 мг/мл, мы наблюдали увеличение подвижности сперматозоидов по сравнению с контролем в течении первых суток, но в дальнейшем (через 2 дня и более) все сперматозоиды переставали двигаться. При более высоких концентрациях C₁₀₅O₁₀K₅ClH₄₀ уже через сутки все сперматозоиды были обездвижены (табл. 2).

Аналогичные результаты были получены и при инкубации подвижной фракции сперматозоидов с C₆₀P₅O₁₅H₆K_5. Было показано, что при инкубации данного вещества с подвижной фракцией сперматозоидов наблюдалось существенное увеличение подвижности сперматозоидов по сравнению с контролем. Так, максимальное увеличение подвижности сперматозоидов по сравнению с контролем наблюдалось при кон­центрации C₆₀P₅O₁₅H₆K₅-1мкг/мл через 3 часа - на 73%, и через 3 суток на 60% (табл. 3).

Таблица 2.

Изменение подвижности сперматозоидов при инкубации с фуллереном C₁₀₅O₁₀K₅ClH₄₀ в разных концентрациях

Таблица 3.

Изменение подвижности сперматозоидов при инкубации с фуллереном C₆₀P₅O₁₅H₆K₅ в разных концентрациях

Чтобы проверить не проявляют ли модифицированные фуллерены C₆₀P₅O₁₅H₆K_5б и C₁₀₅O₁₀K₅ClH₄₀ в концентрации 1мкг/мл в какой-то временной точке токсичных свойств по отношению к сперматозоидам мы оценили как меняется подвижность сперматозоидов, инкубированных с С₈₅N₁₀H₆₀Cl₆, C₆₀P₅O₁₅H₆K₅, C₁₀₅O₁₀K₅ClH₄₀ в данной концентрации в течение 7 дней. Было показано (табл. 4), что инкубация подвижной фракции сперматозоидов как с C₁₀₅O₁₀K₅ClH₄₀ так и  C₆₀P₅O₁₅H₆K₅ при концентрации 1мкг/мл способствовала увеличению подвижности сперматозоидов по сравнению с контролем в течение всей недели. Максимальное увеличение подвижности сперматозоидов (в 2 раза) наблюдалось через 3 суток инкубации с C₆₀P₅O₁₅H₆K₅.

Модифицированный фуллерен С₈₅N₁₀H₆₀Cl₆, напротив, был токси­чен для сперматозоидов даже в концентрации 1 мкг/мл. Что проявлялось как в обездвиживании сперматозоидов, так и в нарушении целост­ности их мембран (табл. 5). Через сутки инкубации с С₈₅N₁₀H₆₀Cl₆ в концентрации 1 мкг/мл все сперматозоиды были обездвижены и нежизнеспособны.

Таблица 4.

Изменение подвижности сперматозоидов при инкубации с С₈₅N₁₀H₆₀Cl₆, C₆₀P₅O₁₅H₆K₅, C₁₀₅O₁₀K₅ClH₄₀ в концентрации 1мкг/мл

Влияние модифицированных фуллеренов С₈₅N₁₀H₆₀Cl₆, C₆₀P₅O₁₅H₆K₅, C₁₀₅O₁₀K₅ClH₄₀ на состояние митохондрий сперматозоидов. Подвижность сперматозоидов зависит от большого числа разнообразных факторов, имеющих сложные механизмы регуляции.

Таблица 5.

Жизнеспособность сперматозоидов при инкубации с модифицированными фуллеренами С₈₅N₁₀H₆₀Cl₆, C₆₀P₅O₁₅H₆K₅, C₁₀₅O₁₀K₅ClH₄₀ в концентрации 1мкг/мл

Способность к перемещению у них развивается по мере созревания в придатке яичка – эпидидимисе и зависит от нормальной работы механизмов, управляющих жгутиком, а также наличия как внутренних, так и внешних энергетических ресурсов. Как и любая другая клетка, сперматозоид использует энергию АТФ для обеспечения жизнедея­тельности: работы ионных каналов, подвижности, и др. В митохондри­альной части жгутика происходит окислительное фосфорилирование, считается, что образованные в митохондриальной части жгутика молекулы АТФ используются для поддержания подвижности спер­матозоидов [10].

Влияние фуллеренов на состояние митохондрий cперматозоидов исследовали по изменению трансмембранного потенциала митохондрий (ΔΨm) используя потенциал-чувствительный маркер MitoTracker Red путем определения средней интенсивности флуоресценции на проточном цитофлуориметре. В ходе исследований установлено, что через час инкубации сперматозоидов с модифицированным фуллереном C₁₀₅O₁₀K₅ClH₄₀ отмечалось увеличение средней интенсивности внутри­клеточной флуоресценции маркера (I_{MitoTracker Red} /кл, усл.ед.), более чем в 2 раза (на 120%), при концентрации 0.01мг/мл и на 46% при концентрации 0.1мг/мл (рис. 2). При концентрации 1мг/мл средняя интенсивность внутриклеточной флуоресценции маркера I_{MitoTracker Red} была практически такой же как в контроле. То есть, в ходе экспериментов было показано, что чем ниже была концентрация C₁₀₅O₁₀K₅ClH₄₀, с которым инкубировали сперматозоиды, тем ярче проявлялся эффект увеличения трансмембранного потенциала мито­хондрий (ΔΨm). Что, впрочем, согласуется с данными по изменению подвижности сперматозоидов в ходе инкубации с фуллереном C₁₀₅O₁₀K₅ClH₄₀.

Рисунок 2. Изменение относительной интенсивности флуоресценции MitoTracker Red в сперматозоидах через час инкубации с модифицированными фуллеренами:1 - C₁₀₅O₁₀K₅ClH₄₀ , 2 - C₆₀P₅O₁₅H₆K₅, 3 - С₈₅N₁₀H₆₀Cl₆, в различных концентрациях

Аналогичные данные были получены нами и после часа инкубации подвижной фракции сперматозоидов с модифицированным фуллереном C₆₀P₅O₁₅H₆K₅. Однако, увеличение средней интенсивности внутрикле­точной флуоресценции маркера I_{MitoTrackerRed} не носило столь выраженный характер, хотя также зависело от концентрации фуллерена. То есть, чем ниже была концентрация C₆₀P₅O₁₅H₆K_5, с которым инкубировали сперматозоиды, тем ярче проявлялся эффект увеличения транс­мембранного потенциала митохондрий (ΔΨm) (рис. 2). Что также согласуется с данными по изменению подвижности сперматозоидов в ходе инкубации с данным модифицированным фуллереном.

Кроме того, в ходе исследований было установлено, что через час инкубации сперматозоидов с модифицированным фуллереном С₈₅N₁₀H₆₀Cl₆ в концентрации 0.01мг/мл, отмечалось уменьшение средней интенсивности внутриклеточной флуоресценции маркера (MitoTracker Red /кл, усл.ед.), на 46%, при концентрации 0,1мг/мл и на 71% при концентрации 1мг/мл (рис 2). То есть, в ходе экспериментов было показано, что чем выше была концентрация модифицированного фуллерена, с которым инкубировали сперматозоиды, тем сильнее прояв­лялось его токсическое воздействие. Эффект уменьшения транс­мембранного потенциала митохондрий (ΔΨm) также согласуется с полученными нами ранее данными по изменению подвижности сперматозоидов в ходе инкубации с модифицированным фуллереном С₈₅N₁₀H₆₀Cl₆.

В дальнейшем, нами были проведены более детальные экспери­менты с модифицированными фуллеренами C₆₀P₅O₁₅H₆K₅, C₁₀₅O₁₀K₅ClH₄₀. Мы использовали более низкие концентрации данных веществ – 1мкг/мл и увеличили время инкубации сперматозоидов с ними. Для этого пред­варительно была выделена подвижная фракция сперматозоидов, согласно протоколу фирмы изготовителя (ПанЭко, Среда ЭКО 1 "Спермопреп").

В ходе исследований установлено, что при инкубации под­вижной фракции сперматозоидов с модифицированным фуллереном C₁₀₅O₁₀K₅ClH_40, в концентрации 1 мкг/мл отмечалось увеличение средней интенсивности внутриклеточной флуоресценции маркера (I_{MitoTracker Red}, усл.ед.) на 73% через 4 часа инкубации, и на 50% через 8 часов инку­бации по сравнению с контролем, через 24 часа средняя интенсивность внутриклеточной флуоресценции маркера (I_{MitoTracker Red} , усл.ед.) была практически такой же как в контроле (табл. 6, рис. 3). Эти данные свидетельствуют о существенном увеличении трансмембранного потенциала митохондрий (ΔΨm) в сперматозоидах, то есть о большей эффективности работы митохондрий под влиянием фуллерена C₁₀₅O₁₀K₅ClH₄₀ в течении первых 8 часов инкубации, что согласуется с данными по изменению подвижности сперматозоидов. Однако, увеличение подвижности сперматозоидов при данной концентрации фуллерена мы наблюдали в течение всей недели, тогда как увеличение трансмембранного потенциала носило обратимый характер и наблю­далось только в течение первых 8 часов.

Таблица 6.

Динамика средней интенсивности флуоресценции I_{MitoTracker Red} в сперматозоидах при инкубации с фуллеренами C₆₀P₅O₁₅H₆K₅, C₁₀₅O₁₀K₅ClH₄₀ в концентрации 1 мкг/мл

Рисунок 3. Изменение средней интенсивности флуоресценции I_{MitoTracker Red} в сперматозоидах в процессе инкубации с модифицированными фуллеренами в концентрации 1 мкг/мл. 1 - контроль, 2 - C₁₀₅O₁₀K₅ClH₄₀ , 3 - C₆₀P₅O₁₅H₆K₅

Аналогичные результаты были получены нами и при инкубации сперматозоидов с модифицированным фуллереном C₆₀P₅O₁₅H₆K₅ в концентрации 1мкг/мл. Отмечалось существенное увеличение средней интенсивности внутриклеточной флуоресценции маркера (I _{MitoTracker Red}, усл.ед.), на 68% через 4 часа инкубации и на 17% через 8 часов инкубации, через 24 часа средняя интенсивность внутриклеточной флуоресценции маркера (I _{MitoTracker Red}, усл.ед.) была практически такой же как в контроле (табл. 6). Эти данные также свидетельствуют о сущест­венном увеличении трансмембранного потенциала митохондрий (ΔΨm) в сперматозоидах в течении первых 4 часов, то есть о большей эффек­тивности работы митохондрий при инкубации с модифицированным фуллереном C₆₀P₅O₁₅H₆K₅ , что также согласуется с данными по изме­нению подвижности сперматозоидов. Однако, как и при инкубации с C₁₀₅O₁₀K₅ClH₄₀ увеличение подвижности сперматозоидов при данной концентрации C₆₀P₅O₁₅H₆K₅ наблюдалось в течение всей недели, тогда как увеличение трансмембранного потенциала носило обратимый характер и наблюдалось только в течение первых 4 часов.

Заключение. Показано, что инкубация сперматозоидов в течение недели с модифицированными водорастворимыми фуллеренами C₆₀P₅O₁₅H₆K₅, C₁₀₅O₁₀K₅ClH₄₀ в концентрации ниже 1мг/мл сопро­вождается повышением их подвижности. Полученные результаты указы­вают на отсутствие цитотоксичности модифицированных водораствори­мыми фуллеренов C₆₀P₅O₁₅H₆K₅, C₁₀₅O₁₀K₅ClH₄₀ в данной концентрации, а также на возможность их использования в качестве стимуляторов активности митохондрий сперматозоидов. Показано, что модифици­рованный водорастворимый фуллерен С₈₅N₁₀H₆₀C_l6 является крайне токсичным по отношению к сперматозоидам. Инкубация мужских половых клеток с данным соединением в концентрации 1мкг/мл и выше приводит к тотальному их обездвиживанию и потери сперматозоидами жизнеспособности.